ประวัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

           การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชได้เริ่มเมื่อ 200 กว่าปีที่แล้วโดย Gautheret (1985) ได้รวบรวมความเป็ยมาของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อและกล่าวว่า Duhamel (1700-1782) ได้ค้นพบการเกิดแคลลัสจากการควั่นเอาส่วนเอาส่วนของคอร์เทกซ์ (cortex) ต้นเอล์ม (elm) ต่อมาพบว่ามีการบวมเหนือบริเวณรอยควั่นและมีหน่อใหม่แทงยอดออกมาตรงบริเวณด้านล่างของรอยควั่น แต่ในสมันนั้นยังไม่ได้ค้นพบเทคนิคปลอดเชื้อ จึงไม่ได้ทดลองติดตาม

            ในปี ค.ศ. 1838 Schwann และ Schleiden ได้เสนอทฤษฎีเซลล์ และในส่วนหนึ่งของทฤษฎีนี้ได้กล่าวไว้ว่าเซลล์แต่ละเซลล์ของสิ่งมีชีวิตนั้นมีคุณสมบัติหนึ่งที่เรียกว่า  totipotency  หมายถึง ความสามารถในของเซลล์ที่จะมีการพัฒนาไปเป็นสิ่งมีชีวิตที่สมบูรณ์ใหม่เมื่อได้รับสภาพแวดล้อมที่เหมาะสม (คำนูณ กาญจนภูมิ. 2542 : 1)

            

            การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

             Street (1977) นิยายคำว่า “การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช” ไว้ว่าหมายถึง การเพราะเลี้ยงชิ้นส่วนพืช (explant) ซึ่งอาจมีหนึ่งหรือมากกว่าหนึ่งเนื้อเยื่อ แล้วได้เป็นแคลลัสขึ้นมา โดยไม่มีโครงสร้างหรือหน้าที่ที่เกี่ยวข้องร่วมกับเนื้อเยื่อเดิมเลย นอกจากนี้  Street ยังได้ให้คำนิยามอื่นๆ ของการเพาะเลี้ยงอีก เนื่องจากพืชประกอบด้วยอวัยวะต่างๆ ซึ่งแต่ละอวัยวะก็ประกอบไปด้วยเนื้อเยื่อหลายชนิด ดังนั้นการเพาะเลี้ยงในหลอดทดลองจึงแบ่งออกเป็นหลายชนิด คือ (คำนูณ กาญจนภูมิ. 2542 : 7)

        1. การเพาะเลี้ยงพืชทั้งต้น คือ การนำเอาเมล็ดไปเพาะในหลอดทดลองจนเป็นต้นกล้าและพืชที่สมบูรณ์ต่อไป เช่น การเพาะเมล็ดกล้วยไม้

        2. การเพาะเลี้ยงเอ็มบริโอ คือ การเพาะเลี้ยงเอ็มบริโอไม่ว่าแก่หรืออ่อน หลังจากที่แยกเอาเปลือกหุ้มเมล็ดออกไปแล้ว

        3. การเพาะเลี้ยงอวัยวะ คือ การเพาะเลี้ยงส่วนต่างๆ ของอวัยวะพืชที่แยกออกมา เช่น ปลายยอด ปลายราก ดอก ผล อับเรณู

        4. การเพาะเลี้ยงแคลลัส คือ การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่เกิดใหม่จากการเพาะเลี้ยงส่วนต่างๆ ของพืช

        5. การเพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอย คือ การเพาะเลี้ยงเซลล์เดี่ยวหรือกลุ่มเซลล์ที่ได้มาจากแคลลัสในอาหารเหลวที่มีการเขย่าตลอดเวลา

         6. การเพาะเลี้ยงโพรโทพลาสต์ คือ การเพาะเลี้ยงเซลล์ที่ผนังเซลล์ถูกย่อยด้วยเอนไซม์


            สารเร่งการเจริญเติบโต 

            การเติมสารที่ช่วยการเจริญลงไปในอาหารนับว่ามีความสำคัญที่จะช่วยให้เนื้อเยื่อเหล่านั้นเจริญได้ดีขึ้น เช่น ออกซิน (auxin), ไซโตไคนิน (cytokinin) และจิบเบอเรลลิน (gibberellin) อย่างไรก็ตามความต้องการของของเนื้อเยื่อต่อสารเหล่านี้ก็แตกต่างกันไปและเชื่อว่ามันเกี่ยวข้องกับระดับฮอรโมนที่มีอยู่ภายในพืชด้วย

            ออกซิน ((auxin) ในธรรมชาติฮอร์โมนกลุ่มนี้เกี่ยวข้องกับการยืดของลำต้นและปล้อง, การโค้งเข้าหาสิ่งเร้า (tropism), การยับยั้งการเจริญของตาข้าง (apical dominance), การหลุดร่วงของใบ  ดอกและผล, การเกิดราก เป็นต้น ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชได้นำเอาออกซินไปใช้ในการกระตุ้นการแบ่งเซลล์และการเกิดราก ออกซินที่นิยมใช้ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

IAA	(Indoleacetic acid)
IBA	(Indole-3-butyric acid)
NAA	(Naphthalene acetic acid)
NOA	(Naphthoxyacetic acid)
p-CPA	(para – Chlorophenoxyacetic acid)
2,4-D	(2,4 – Dichlorophenoxy acetic acid)
2,4,5-T	(2,4,5 – Trichlorophenoxy acetic acid)

             อย่างไรก็ตามออกซินที่นิยมใช้กันแพร่หลายได้แก่ IBA และ NAA เพื่อกระตุ้นให้เกิดราก และใช้ร่วมกับไซโตไคนินเพื่อการเจริญของต้น ส่วน 2,4-D และ 2,4,5-T มีผลต่อการกระตุ้นให้เกิดการเจริญของแคลลัสได้ดี โดยทั่วไปการละลายออกซินให้แอลกอฮอล์ (ethanol) หรือ NaOH เจือจางเป็นตัวทำละลาย

             ไซโตไคนิน (cytokinin) ฮอร์โมนกลุ่มนี้มีผลต่อการแบ่งเซลล์ ช่วยการเจริญของตาข้าง การเกิดและการเจริญของต้น การเติมไซโตไคนินลงไปในอาหารที่เพาะเลี้ยงก็เพื่อช่วยให้กระตุ้นการแบ่งเซลล์และการเปลี่ยนแปลงไปเป็นหน่อเล็กๆ (adventitious shoot) จากส่วนของแลลลัสหรืออวัยวะที่เพาะเลี้ยง ไซโตไคนินที่นิยมใช้มีดังนี้

BAP	(Benzylamino purine)
2,iP	(Isopentonyl - adenine)
Kinetin	(6 – Furfurylamino purine)

การละลายไซโตไคนินใช้กรดเกลือเจือจาง HCl หรือ NaOH เจือจาง

             จิบเบอเรลลิน (gibberellin) ที่ทราบอยู่ในปัจจุบันมีมากกว่า 20 ชนิด ที่ใช้กันทั่งไป คือ GA₃ การละลายใช้น้ำเป็นตัวทำละลาย (น้ำเย็น)  (บุญยืน กิจวิจารณ์, 2544 : 18-19)


           ห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

        ประกอบด้วยส่วนสำคัญ 3 ส่วนคือ
        1. ห้องเตรียมอาหาร (Medai preparation room)  ควรเป็นห้องที่มีโต๊ะสำหรับเตรียมสารเคมี อ่างน้ำ ตู้เย็น สำหรับเก็บสารละลายเข้มข้น เครื่องชั่ง เครื่องวัดความเป็นกรด-ด่าง เตาหลอมอาหาร หม้อนึ่งฆ่าเชื้อจุลินทรีย์แบบความดันไอน้ำ
        2. ห้องถ่ายเนื้อเยื่อ (Transfer or incubation room) เครื่องมือสำคัญในห้องนี้คือ ตู้สำหรับเลี้ยงหรือถ่ายเนื้อเยื่อเป็นตู้ที่มีอากาศถ่ายเทผ่านแผ่นกรอง ที่สามารถกรองจุลินทรีย์ไว้ได้ตลอดเวลา ทำให้อากาศภายในตู้บริสุทธิ์ ช่วยให้ทำงานสะดวกรวดเร็ว
         3. ห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช  (Culture room) สภาพแวดล้อมที่เหมาะสมในการเลี้ยงเนื้อเยื่อจะแตกต่างกันสำหรับพืชแต่ละชนิด โดยทั่วไปมักจะปรับสภาพแวดล้อมภายในห้องให้มีอุณหภูมิประมาณ 25 องศาเซลเซียส ระยะเวลาที่ให้แสงประมาณ 12-16 ชั่วโมง/วัน ความเข้มของแสง 1,000-3,000 ลักซ์ 
          การดูแลห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชจะต้องสะอาดอยู่เสมอ หมั่นตรวจดูขวดหรือภาชนะที่เลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ถ้าพบว่ามีจุลินทรีย์ขึ้นปะปน จะต้องรีบนำออกไปต้มฆ่าเชื้อและล้างทันทีไม่ให้เป็นที่สะสมเชื้อจุลินทรีย์ ซึ่งอาจแพร่กระจายภายในห้องได้


            อุปกาณ์ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ  

        1. พันธุ์พืชที่จะนำมาเพาะเลี้ยงควรสะอาด ปราศจากโรคและเป็นส่วนที่สำคัญที่ยังอ่อนอยู่ เช่น ตาเป็นอวัยวะที่ดีที่สุด ส่วนใบ ดอก ราก ก็สามารถนำมาเลี้ยงได้
        2. เครื่องแก้วต่าง ๆ ได้แก่ ฟลาสค์ บีคเกอร์ ปิเปตต์ จานเพาะเชื้อ กระบอกตวง ขวดสำหรับเลี้ยงเนื้อเยื่อ
       3. สารเคมีต่าง ๆ
              - สารเคมีที่ใช้ฆ่าเชื้อที่ติดมากับผิวพืช เช่น คลอรอกซ์ เอททิลแอลกฮอล์ เมอคิวริคคลอไรด์ ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์
              - สารเคมีที่ใช้เตรียมสูตรอาหารต่าง ๆ
              - สารเคมีที่ควบคุมการเจริญเติบโต
              - น้ำตาลซูโครส
              - ผงวุ้น 
       4. เครื่องมือผ่าตัด ได้แก่ มีดผ่าตัด ปากคีบ
       5. ตู้ถ่ายเนื้อเยื่อ
       6. อุปกรณ์เบ็ดเตล็ดต่าง ๆ
       7. อาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

           วิธีการเตรียมอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ
        1. นำสารละลายเข้มข้นชนิดต่าง ๆ มาผสมกัน ค่อย ๆ กวนให้เข้ากันจนหมดครบทุกชนิด
        2. เติมน้ำตาล แล้วเติมน้ำกลั่นให้ได้ปริมาตรที่ต้องการ ปรับ pH 5.6 – 5.7
        3. นำวุ้นผสมกับอาหารที่เตรียม หลอมวุ้นให้ละลาย
        4. บรรจุลงในขวดอาหารในปริมาตรเท่า ๆ กัน ปิดฝาให้สนิท
        5. นำอาหารไปนึ่งในหม้อนึ่งความดันไอน้ำเพิ่อฆ่าเชื้อ

            ประโยชน์ของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

            ประโยชน์ของวิธีเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อมีหลายข้อพอสรุปได้ดังนี้

       1. สามารถผลิตต้นพันธุ์พืชปริมาณมาณมากในระยะเวลาอันรวดเร็ว ตัวอย่างเช่น หากพืชสามารถเพิ่ม ปริมาณได้ 3 เท่า ต่อการย้ายเนื้อเยื่อลงอาหารใหม่ทุกเดือนๆ ละ 1 ครั้ง เมื่อเวลาผ่านไป 6 เดือน จะสามารถผลิต ต้นพันธุ์พืชได้ถึง 243 ต้น

        2. ต้นพืชที่ผลิตได้จะปลอดโรค โดยเฉพาะโรคที่มีสาเหตุจากเชื้อไวรัส มายโคพลาสมา ด้วยการตัด เนื้อเยื่อเจริญที่อยู่บริเวณปลายยอดของลำต้น ซึ่งยังไม่มีท่อน้ำท่ออาหาร อันเป้นทางเคลื่อนย้ายของเชื้อโรค ดังกล่าว

        3. ต้นพืชที่ผลิตได้ จะมีลักษณะทางพันธุกรรมเหมือนต้นแม่ คือ มีลักษณะตรงตามพันธุ์ ด้วยการใช้ เทคนิคของการเลี้ยงจากชิ้นตาพืชพัฒนาเป็นต้นโดยตรง หลีกเลี่ยงขั้นตอนการเกิดกลุ่มก้อนเซลล์ที่เรียกว่า แคลลัส

         4. ต้นพืชที่ผลิตได้จะมีขนาดสม่ำเสมอ ผลผลิตที่ได้มีมาตรฐานและเก็บเกี่ยวได้คราวละมากๆ พร้อมกัน หรือในเวลาเดียวกัน

         5. เพื่อการเก็บรักษาหรือแลกเปลี่ยนพันธุ์พืชระหว่างประเทศ เช่น การมอบเชื้อพันธุ์กล้วยในสภาพปลอดเชื้อ ขององค์กรกล้วยนานาชาติ (INIBAP) ให้กรมส่งเสริมการเกษตร เมื่อปี พ.ศ. 2542

         6. เพื่อประโยชน์ด้านการสกัดสารจากต้นพืช นำมาใช้ประโยชน์ด้านต่างๆ เช่น ยาฆ่าแมลง ยารักษาโรค เป็นต้น 

_____✱✱✱✱✱✱_____

ตัวอย่างงานวิจัย (For research)

References : Guek Eng Sim . Chiang Shiong Loh . Chong Jin Goh
Plant Cell Rep (2007) 26:383–393

   กล้วยไม้ที่ออกดอกตามปกติจะเจริญในหลายประเทศเขตร้อน เช่น  ประเทศไทย สิงคโปร์ และมาเลเซีย การเพาะเลี้ยงให้ออกดอกในหลอดทดลองจะช่วยประเมินลักษณะที่ต้องการบางอย่างของดอก เช่น ขนาด รูปร่าง โทนสี  การแปรผันสีดอก เมื่อได้ลักษณะที่ต้องการจะถูกนำมาเพิ่มจำนวนขยายพันธุ์ผ่านการ เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ  กล้วยไม้ที่ออกดอกในหลอดทดลอง จะมีดอกขนาดเล็กซึ่งมีมูลค้าสูงในเชิงการค้า ซึ่งการทดลองในครั้งนี้เพื่อย่นระยะเวลาในการออกดอกของ Dendrobium Madame Thong-In ที่ยังมีอายุน้อยในหลอดทดลอง และเพื่อศึกษาผลของ CW (Coconut water) และ BA (Benzylaminopurine) ในสูตรอาหาร two-layered medium ในการชักนำเนื้อเยื่อเจริญช่อดอกให้

            ขั้นตอนการทดลอง   

        1. เตรียมอาหาร KC สูตรดัดแปลง 25 mL โดยมีส่วนผสมของ Sucrose 2% , Coconut water 15% , Activated charcoal 0.03% , Agar  0.3% 

       2. นำอาหาร KC ที่เตรียมนึ่งในหม้อนึ่งความดึนไอน้ำ(atoclaveing 1 kg cm-2) ที่อุณหภูมิ 121 ๐C นาน 20 นาที

        3. ล้างฝักกล้วยไม้ให้สะอาด จากนั้นนำมาฟอกฆ่าเชื้อด้วย clorox 100%  ผ่าฝักตามยาวเพื่อนำมาเพาะเลี้ยงในอาหาร KC สูตรดัดแปลง 

       4. เมื่อทำการเพาะเลี้ยงผ่านไปเป็นเวลา 2 เดือน  ทำการย้าย green protocorms ที่มีความสูง 2-3 mm และมี 2-3 ใบมายังสูตรอาหาร basal liquid medium ที่เสริม 4.4 μM BA (K1) ทำการเพาะเลี้ยงใน Erlenmeyer flasks ขนาด 100 ml 

        5. เมื่อ protocorms เจริญแล้วทำการย้ายมาเพาะเลี้ยงยังสูตรอาหาร Two-layered medium ที่มีส่วนประกอบของ 0.3%  Gelrite - solidified basal medium (KR) 50 ml 0.03% ผงถ่าน วางทับด้วย  Basal liquid medium 20 ml เสริมด้วย 22.2  μM BA (K5)
            

ตารางสูตรอาหาร Two - layered medium 

        6. ศึกษาระยะการเจริญของ protocorms บนสูตรอาหาร two-layered medium 

  

• state I, elongated protocorms (สูง7–8 mm)

• state II, เริ่มมีก้านช่อดอก

• stage III, เริ่มมีตาดอก     

            ผลการทดลอง

Fig.  In vitro flowering of Dendrobium Madame Thong-In. ( Bar : 1 cm)

Fig a.  Protocorms   Fig b. shoots withnormal (N) and abnormal flowers (ab) in liquid medium       

 Fig c. flowers bloomed after 34 days   Fig d. shoot showing an inflorescence stalk with 6 flowers

Fig e. two white flowers before pollination   Fig f. one seedpod set after cross-pollinated

            สรุปผลการทดลอง

qในกล้วยไม้ Dendrobium Madame Thong - In, CW เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการเจริญของ protocorms และการเปลี่ยนแปลงของเนื้อเยื่อเจริญปลายยอดไปเป็นเนื้อเยื่อเจริญช่อดอก

qการศึกษาครั้งนี้พบว่า CW เป็นส่วนสำคัญสำหรับการชักนำให้เกิดก้านช่อดอกใน D. Madame Thong - In ที่สอดคล้องกับ  Doriella Tiny (Duan and Yazawa 1994)

q  ไซโตไคนินเป็นส่วนสำคัญที่ใช้ในการออกดอกในหลอดทดลอง (Nitsch และ Nitsch 1967; Bernier 1988; Peeters et al.1991) 

q การเติมไซโตไคนิน  iPAdos (isopentenyl adenosine) พบว่าจะมีประสิทธิภาพกระตุ้นการสร้างตาดอกในหลอดทดลองใน  Arabidopsis (He and Loh 2002)

q ในการศึกษานี้  BA  เพียงอย่างเดียวไม่ได้มีประสิทธิภาพในการชักนำให้เกิดดอก อย่างไรก็ตามจะต้องมี CW ร่วมด้วย

เอกสารอ้างอิง

                   Guek Eng Sim. Chiang Shiong Loh. Chong Jin Goh. Plant cell Rep (2007) 26 : 383-393
บุญยืน กิจวิจารณ์.  เทคโนโลยีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช.  ขอนแก่น : คลังนานาวิทยา,  2544
คำนูณ กาญจนภูมิ.  การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช.  กรุงเทพฯ : จุฬาลงกรณืมหาวิทยาลัย, 2542

http://www.kasetcity.com/data/articledetails.asp?GID=240
http://www.freewebs.com/sakesan/main_issue.htm

_____✱✱✱✱✱✱_____

ติดต่อ : Minbotbio@gmail.com

58 ม.10 อ.ชื่นชม จ.มาหาสารคาม หรือ

คณะวิทยาศาตร์   ภาควิชาชีววิทยา  จังหวัดมหาสารคาม